随着养殖业的快速发展，人工配合饲料的使用量逐年增加，导致饲料资源日趋紧张。因此，传统饲料资源的高效利用及新型饲料资源的开发就显得尤为重要。为了解决上述问题，近年来，人们逐渐将目光转移到发酵饲料这个新型饲料资源上。发酵饲料是以配合饲料为发酵底物，选择接种特定的微生物，人工控制温度、水分、需氧量等条件，通过微生物自身繁殖和代谢来生产的富含高活性益生菌及其代谢产物的饲料。与传统饲料相比，发酵饲料具有抗营养因子含量低、营养价值高、小分子蛋白和肽类含量高等优点。目前，发酵饲料已用于凡纳滨对虾( Litopenaeus vannamei) 、黑鲷( Acanthopagrus schlegelii) 、斑点叉尾 ( Ictalurus punctatus) 、草鱼( Ctenopharyngodon idellu) 等的研究。但相对而言，其在水产中的应用研究尚较少，相关作用机制和效果还有待进一步探究。此外，不同发酵饲料由于使用的微生物菌株及发酵工艺不同，其应用效果差异较大，较难获得稳定、一致的效果。

微生物发酵是发酵饲料加工过程中的一个重要环节，在此过程中往往会产生一定的酸类物质。因此，过量使用发酵饲料往往会导致水产动物肠道 pH 值下降、肌肉中酸性物质的沉积并对其造成应激，进而其肠道损伤、肌肉品质下降和免疫机能受损，最终影响动物的生长性能、抗病力和养殖效益。鉴于此，在评估发酵饲料在水产养殖中的应用潜力时，考察其对动物肠道消化吸收功能、肌肉品质及免疫机能的影响显得尤为重要。

因此，为了对发酵饲料在水产养殖中的应用效果进行科学评估，本试验以我国重要经济鱼类———鲤鱼( Cyprinus carpio) 为研究对象，从生长性能、体组成、肠道消化酶活性、肌肉品质及免疫机能等方面入手，探讨了发酵饲料对鲤鱼幼鱼生长性能及生理功能的影响，以期为发酵饲料在水产饲料中的应用和新型水产饲料资源的开发提供技术依据。

1 材料与方法

1．1 试验设计与饲料组成

本试验中所用的发酵饲料和益生菌由南京宝辉生物饲料有限公司提供，其他原料均由徐州正昌饲料有限公司提供。发酵饲料是以豆粕、菜粕、次粉、玉米等作为底物，由酵母菌、芽胞杆菌和乳酸菌作为发酵菌种，并采用好氧和厌氧方法进行发酵而成。其成分大致如下( 本文中“%”除特别注明外，均表示质量分数) : 水分 42%、粗蛋白 18%、粗灰分 3%、粗脂肪 1．3%、粗纤维 6%。本试验共配制 5 组试验饲料: 基础饲料( 对照组， G1) 以鱼粉、豆粕、菜粕和棉粕为主要蛋白源，以麸皮和面粉为糖源，鱼油和豆油等比例添加为脂肪源。G2 和 G3 组的饲料是在基础饲料中添加 2．5%和 5% 的发酵饲料( 鲜样) 。此外，设定 2 个替代组: 以 5% 与 10% 的发酵饲料( 鲜样) 等蛋白替代对照组的菜粕，即 G4 和 G5 组。试验饲料的配方及营养成分含量见表 1。将原料粉碎后过 60 目筛，然后与磷酸二氢钙、预混料和食盐等微量原料进行预混合，再将其加入其他粉碎原料中逐级充分混匀，加入油脂和适量水后用小型制粒机制成粒径 2 mm 的颗粒饲料，室温避光晾干后保存于－20 ℃ 冰箱冷藏备用。

1．2 试验鱼与养殖管理

养殖试验在南京农业大学浦口试验基地的户外网箱内进行，试验所用鲤鱼由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心提供。正式试验开始前，将鲤鱼暂养于网箱中，期间投喂商品饲料使其适应试验环境。驯化 1 周后，将 300 尾体格健壮、规格整齐、初始体质量为( 25．23±0．06) g 的鲤鱼随机分成 5 组，每组 4 个重复，每个重复 15 尾鱼，置于一个网箱中。养殖试验的 20 个网箱( 规格为 1．0 m×1．0 m×1．5 m) 在同一池塘中进行，养殖期为 10 周。每组饲喂 1 种饲料，每日定时饱食投喂 3 次( 07: 00、11: 30 和 16: 00) ，每日观察并记录鱼摄食及死亡情况。试验期间水温 25 ～ 35 ℃ ， pH 值为 7．0 ～ 7．5，溶解氧含量大于 5．0 mg·L－1，氨氮含量小于 0．01 mg·L－1。

1．3 样品采集与分析测定

1．3．1 样品采集

养殖试验结束后将鱼饥饿 24 h，以排空其肠道内容物，然后，从每个网箱随机选取 4 尾鱼，用 100 mg·L－1间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐( MS－222，美国 Sigma 公司) 进行麻醉处理。将鱼置于冰袋上，用经肝素钠抗凝处理的医用注射器从尾静脉采血，血样置于 2 mL 的抗凝管中，于 4 ℃、3 000 r·min－1离心 10 min。将血浆样品置于－40 ℃ 冰箱中保存，用于血浆生化指标的测定。然后，将鱼迅速解剖，逐级分离出肝脏、腹脂和肠道并称质量。将上述样品用 4 ℃ 预冷后的生理盐水冲洗干净后用滤纸吸干表面水分，并快速置于－40 ℃ 冰箱中冷冻保存，用于后续测定工作。内脏采集完毕后，用手术刀剥开背部皮肤，切取 2 块肌肉放入密封袋中，快速置于－40 ℃ 冰箱中冷冻保存，用于肌肉品质的测定。此外，每组保留 2 尾全鱼，置于－40 ℃ 冰箱中冷冻保存，用于体组成的测定。

1．3．2 饲料和鱼体组成含量测定

将饲料和鱼体称质量后置于培养皿中，在 105 ℃ 的烘箱中烘至恒质量后计算得到水分含量; 粗蛋白( N×6．25) 含量采用全自动凯氏定氮仪( FOSS KT260，瑞士 FOSS 公司) 测定;粗脂肪含量采用索氏抽提仪测定; 粗灰分采用高温灼烧法测定; 总能采用氧弹测热仪( Parr 1281，美国PARR 公司) 测定。

1．3．3 肉品质指标测定

肌肉系水力参照陈代文等的方法进行测定并作适当修改。取 5 g 左右的新鲜背部肌肉， 4 ℃ 悬挂贮存一段时间后( 保鲜肉) ，称质量，求出滴水损失。滴水损失的多少反映系水力( water-holding capacity) 大小。

滴水损失、蒸煮损失和含肉率等肉品质相关指标的计算公式如下:

滴水损失 = ( 贮存前肉质量－贮存后肉质量) /贮存前肉质量×100%，

蒸煮损失 = ( 蒸煮前肌肉质量－蒸煮后肌肉质量) /蒸煮前肌肉质量×100%，

含肉率 = ( 鱼体肉质部分质量 /鱼体质量) ×100%。

每个网箱随机选取 4 条鱼，剥去背肌部分皮肤，用美能达色度计( CR－10， Minolta，日本) 测定肌肉肉色相关指标。

肌肉质构分析: 在采样后 24 h 内，每组选 4 尾鱼，各取 1 cm3 背部肌肉，使用质构仪( TA． XT Plus，Stable Micro Systems，英格兰) 与直径为 50 mm 的铝制压缩板进行测定。用 Exponent 软件( Stable Micro Systems Version 6．0) 记录测定数据。考察参数主要包括硬度、黏附性、内聚性、咀嚼性以及弹性等，参照Hixson 等的方法进行处理。

1．3．4 血浆生理生化指标测定

血液生化指标中的总蛋白和白蛋白含量均采用南京建成生物工程研究所的试剂盒检测。其中，总蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定，白蛋白含量采用溴甲酚绿比色法测定。补体C3 与 C4 含量和免疫球蛋白 M( IgM) 含量用 ELISA 法测定。血浆髓质过氧化物酶( MPO) 和溶菌酶活性参照 Zhang 等的方法测定。皮质醇含量参照陈群等的方法测定。

1．3．5 肝脏抗氧化性能测定

准确称取适量肝脏组织，在冰浴条件下，按照组织与生理盐水质量体积比为 1 ∶9 的比例混合后进行匀浆，制成 10%( 体积分数) 的匀浆液，然后于 4 ℃、3 000 r·min－1 离心 10 min。取上清液用于超氧化物歧化酶( SOD) 、过氧化氢酶( CAT) 和谷胱甘肽过氧化物酶( GSH-Px) 活性以及丙二醛( MDA) 含量和总抗氧化能力( T-AOC) 的测定。样品上清液中的蛋白质含量采用考马斯亮蓝比色法测定。肝脏 SOD、CAT 和 GSH-Px 活性按照 Li 等的方法测定。MDA 含量采用硫代巴比妥酸法测定。T-AOC 参考鞠雪等的方法测定。

1．3．6 肠道消化酶活性测定

准确称取适量肠道样品，在冰浴条件下，按照组织与生理盐水质量体积比为 1 ∶9 的比例混合后进行匀浆，制成 10%的匀浆液，然后于 4 ℃、3 000 r·min－1离心 10 min。取上清液用于蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性的测定。蛋白酶活性采用福林－酚法测定; 脂肪酶活性参照 Furne 等的方法测定; 淀粉酶活性采用碘－淀粉比色法测定; 各管肠道匀浆样品中蛋白含量采用考马斯亮蓝法测定。

1．4 生长性能指标及其计算方法

鱼体生长性能相关指标: 增重率( WG) 、特定生长率( SGR) 、饲料系数( FCR) 、蛋白效率比( PER) 、氮 /能量保留率( N /ERE) 、肥满度( CF) 、肝体比( HSI) 、脏体比( VCI) 、腹脂率( IPF) 的计算公式如下:

WG= ( Wt － W0 ) /W0 × 100%; SGR = ( lnWt － lnW0 ) /T × 100%; FCR = F/( Wt － W0 ) ; PER = ( Wt － W0 ) / ( F×CP) ; N/ERE= ［( Wt×Ct ) －( W0 ×C0) ］ /( F×C) ×100%; CF = Wt /L3 ×100%; HSI = W肝 /Wt ×100%; VCI = W内脏 /Wt×100%; IPF=W腹脂 /Wt×100%。

以上公式中: W0 为鱼的初始体质量( g) ; Wt 为试验结束时鱼的终末体质量( g) ; L 为试验结束时鱼的体长( cm) ; T 为养殖时间( d) ; F 为摄食量( g) ; CP 为试验饲料中的蛋白质含量( %) ; C 为试验饲料中的养分含量( %) ; C0 为鱼体初始养分含量( %) ; Ct 为养殖结束后鱼体的养分含量( %) ; W肝、W内脏 和 W腹脂 分别表示肝脏、内脏和腹脂质量。

1．5 数据统计与分析

采用 SPSS 20．0 软件对试验数据进行单因素方差分析( one-way ANOVA) ，数据差异显著时，采用Duncan's检验法进行多重比较，差异水平定为 0．05。试验结果均保留 2 位小数，并以 x珋±SE 表示。

2 结果与分析

2．1 发酵饲料对鲤鱼生长性能的影响

由表 2 可知: 各组饲料对鲤鱼的终末体质量、增重率、特定生长率、摄食量、蛋白效率比、氮保留率、能量保留率、肥满度、肝体比、脏体比和腹脂率均无显著影响( P＞0．05) ，但显著影响饲料系数( P＜0．05) 。与G1 组相比， G3、G4、G5 组的饲料系数显著降低， G2 组无显著变化，而 G3、G4、G5 组间的饲料系数差异不显著( P＞0．05) 。

2．2 发酵饲料对鲤鱼体组成的影响

由表 3 可知: 各组饲料对鲤鱼的水分、蛋白质、灰分、脂肪含量和能量水平均无显著影响( P＞0．05) 。

2．3 发酵饲料对鲤鱼肠道消化酶活性的影响

由表 4 可知: 各组饲料对鲤鱼的肠道蛋白酶活性无显著影响。G4 组的脂肪酶活性最高，并显著高于G1、G2 和 G5 组( P＜0．05) 。G1 组的淀粉酶活性最高，并显著高于 G3 和 G5 组( P＜0．05) 。

2．4 发酵饲料对鲤鱼肌肉品质的影响

各组饲料对鲤鱼的系水力、蒸煮损失、含肉率、硬度、弹性、咀嚼性、内聚性、黏附性以及肉色 a* 、b* 、L* 值均无显著影响( P＞0．05) ( 表 5) 。

2．5 发酵饲料对鲤鱼非特异性免疫机能的影响

各组饲料对鲤鱼的血浆血糖水平、溶菌酶活性以及总蛋白、球蛋白和补体 C4 含量均无显著影响( P＞0．05) 。各组 IgM 含量均无显著差异( P＞0．05) 。对照组的血浆皮质醇水平和补体 C3 含量均与 G2 组之间差异不显著( P＞0．05) ，但却显著低于其他各组( P＜0．05) 。G1、G2 和 G3 组间的血浆髓质过氧化物酶活性差异不显著( P＞0．05) ，但均显著高于 G4、G5 组( P＜0．05) ( 表 6) 。

2．6 发酵饲料对鲤鱼肝脏抗氧化性能的影响

由表 7 可知: 各组饲料对鲤鱼肝脏的 CAT、T-AOC、SOD 和 GSH-PX 活性以及 MDA 含量均无显著影响( P＞0．05) 。

3 讨论

为了贴近实际生产并更真实地反映发酵饲料的使用效果，本试验在配置饲料时采用了 2 种方法，即直接添加和等蛋白替代。直接将发酵饲料添加至基础饲料中的依据在于，在生产实践中绝大多数企业的饲料配方较为固定，调整其饲料配方具有较大的难度，并会在一定程度上增加饲料生产成本。因此，考虑将发酵饲料作为一种微量的原料直接添加，具有较强的可操作性。将发酵饲料等蛋白替代基础饲料中的菜粕的依据在于，发酵饲料的粗蛋白水平为 18%、水分为 42%，烘干后其蛋白水平与菜粕最为接近，用它替代菜粕，不仅能够满足与对照组等氮的需要，且对饲料配方的改动较小。

3．1 发酵饲料对鲤鱼生长性能和肌肉品质的影响

本试验中，发酵饲料等蛋白替代 5%菜粕组显著降低了鲤鱼的饲料系数，且这组的摄食量比其他组低。这表明，这组鲤鱼的饲料利用率较高，增长单位体质量消耗的饲料量最少。使用这种饲料将显著降低养殖成本。究其原因，一方面可能是经过微生物发酵后，饲料中植物蛋白源中的抗营养因子含量显著降低或者被消除; 同时，一部分大分子蛋白被降解成能够被水产动物直接消化吸收的小分子蛋白、小肽和氨基酸。经过上述过程，饲料的营养价值得以改善，进而提高了动物机体的利用率。另一方面，随着发酵饲料添加或替代量的增加，饲料的酸度会发生变化，这在一定程度上会影响饲料的适口性，进而抑制动物的食欲，最终造成摄食量下降。此外，发酵饲料中的益生菌可以在动物机体肠道内生长繁衍，促进肠道内维生素、蛋白质和氨基酸等营养成分的消化吸收，提高了饲料利用率进而改善了机体的生长性能。值得注意的是，发酵饲料等蛋白替代 5%菜粕组饲料的水分含量高于其他组，这也可能对结果造成一定影响。系水力是最重要的肉品质指标之一，其大小经常用滴水损失来描述，滴水损失越多表示系水力越小。滴水损失越低肉质越好。此外，含肉率的高低也是评价鱼类肌肉品质、经济性状和生产性能的重要指标之一。而肌肉的颜色( 肉色) 是肉品质优劣的外观表现，是人们能够看到、感觉到的最直观的印象。质构能反映肉质的软硬程度和弹性，是肉品食用的主要指标。在本试验中，发酵饲料对肌肉的系水力、蒸煮损失、含肉率、质构以及肉色均无显著影响。究其原因，一方面可能是发酵饲料对各组鱼体肌肉营养成分和蛋白质结构没有产生显著影响，从而未对肌肉品质造成影响; 另一方面，可能是发酵饲料需要添加到一定量时才会对肌肉品质产生显著影响，而本试验中发酵饲料的添加量较低，最高的只有10%，不足以造成显著影响。这也表明，发酵饲料可以很好地被鲤鱼利用，而不会对其肌肉品质产生显著影响。

3．2 发酵饲料对鲤鱼消化酶活性的影响

研究表明，肠道是动物营养物质消化吸收的主要场所。鱼类( 尤其是无胃鱼类) 主要靠消化酶进行化学性消化，因此肠道消化酶活性可以在一定程度上反映鱼类的消化能力。本试验中，肠道脂肪酶活性和淀粉酶活性以等蛋白替代 5% 菜粕组为最高，等蛋白替代 10% 菜粕组的脂肪酶和淀粉酶活性均较低，而各组间蛋白酶活性相差不大。这表明，发酵饲料可以在一定程度上提高鲤鱼肠道消化酶活性，进而改善其消化机能，但过量的发酵饲料会影响肠道的消化功能。其原因可能是，饲料经发酵后产生的有机酸、菌体活性蛋白、叶酸以及益生菌等物质能有效改善动物的消化道微生态环境，促进消化酶分泌，且益生菌在增殖过程中会分泌一定的酶类，对内源性酶进行一定补充，从而提高机体的肠道消化酶活性;也可能是，发酵饲料中抗营养因子的降低或消除，使原料营养成分迅速转化，进而提高动物机体的消化吸收能力。但是，过量添加发酵饲料会引起肠道内酸度过高，导致消化酶活性下降，进而对肠道消化吸收功能造成负面影响。

3．3 发酵饲料对鲤鱼免疫机能及肝脏抗氧化能力的影响

本试验中，发酵饲料等蛋白替代 5% 菜粕组的皮质醇和补体 C3 含量均高于对照组，而髓质过氧化物酶的活力则显著低于对照组。这可能是发酵饲料和益生菌在一定程度上提高了鲤鱼的非特异性免疫机能。这是因为，血液中血糖和皮质醇水平升高，在一定程度上反映动物机体出现了轻微的应激反应; 而补体 C3 含量提高，反映发酵饲料能刺激机体的非特异性免疫反应，进而提高其免疫机能; 此外， MPO 活性与中性粒细胞的功能和活力密切相关，其活力下降反映组织细胞的应激反应减弱。究其原因，一方面可能是发酵饲料中的小分子蛋白、肽类和游离氨基酸含量相对较高，能够在一定程度上增强机体的非特异性免疫力; 另一方面可能是发酵饲料中的益生菌能够激发机体的体液免疫和细胞免疫来增强机体免疫机能。

细胞在代谢过程中会产生大量的自由基，当其过量时会导致机体氧化损伤，如细胞膜完整性受损和DNA 结构破坏等。同时，动物机体内有一套防御系统，其由多种抗氧化酶和还原性物质构成。其中， GSH能够与自由基结合， SOD 可以将 O·－2转化为 H2O2，而 GSH-Px 在 GSH 的参与下，催化 H2O2 的分解，从而清除自由基。本试验中，发酵饲料对鲤鱼肝脏中的 SOD、CAT、GSH-Px、MDA 和 T-AOC 等均无显著影响。这表明，在饲料中添加发酵饲料和益生菌没有影响鲤鱼的抗氧化能力。此试验结果与王一娟等和徐奕晴等在中华绒螯蟹上的研究结果不一致。究其原因，一方面可能是益生菌和发酵饲料对动物机体抗氧化能力的调节作用存在种间特异性，且与蛋白源的替代水平及动物养殖周期的长短等因素密切相关; 另一方面可能是本试验中发酵饲料添加量相对较低，不足以影响机体的抗氧化功能。

本试验结果表明，发酵饲料等蛋白替代 5%菜粕组的饲料系数较低、肠道消化酶活性较高且非特异性免疫机能较强，而其蛋白效率比及氮保留率均与对照组相差不大，表明这组饲料不仅可以提高鱼体对饲料的利用率，还可以在一定程度上改善鱼体的消化机能和免疫力。在实际生产中，使用这组饲料来饲喂鲤鱼，将会在一定程度上降低饲料消耗量并改善鱼体抗病力，进而降低养殖成本并改善养殖效益，也不会影响鲤鱼的肌肉品质。

参考文献（略）。